Diagnóstico serológico
de Sífilis

La Sífilis es una infección crónica con periodos de agudización,causada por una espiroqueta Treponema pallidum subsp. pallidum. Debido al fracaso en el cultivo del T. pallidum se han desarrollado distintos métodos para diagnosticar la infección en los distintos estadios de la sífilis. Los métodos se clasifican en cuatro categorías: a) Examen microscópico directo (campo oscuro) del material de la lesión; b) tests no treponémicos, usados para tamizage; c) tests treponémicos que detectan anticuerpos específicos, utilizados como confirmatorios; y d) tests para la detección directa del antígeno( en desarrollo).

• Tests no treponémicos:

En 1906, Wasermann efectuó la primera prueba serológica para Sífilis, basada en una reacción de fijación de complemento donde el antígeno no era
el Treponema pallidum, sino una sustancia lipidica presente en hígados de recién nacidos sifilíticos, al principio se penso que esta sustancia era especifica, pero muy pronto se demostró que este antígeno esta presente en hígado normal y en extractos alcohólicos de numerosos tejidos humanos o animales. Para aumentar la sensibilidad de estos antígenos se agrego lecitina y colesterol. Los tests de fijación de complemento fueron reemplazados
en 1917 por tests de precipitación. En 1922, Kahn introduce tests de floculación que no requieren complemento y pueden ser leídos macroscópicamente en pocas horas. Estos tests fueron modificados a través del tiempo pero carecían de estandarización. En 1941, Pangborn aisló y purificó de tejido cardiaco de buey el componente antigénico activo: cardiolipina. La cardiolipina, combinada con lecitina y colesterol constituyen antígenos que pueden ser estandarizados química
y serológicamente, asegurando así mayor reproducibilidad intra e inter ensayo.

Los tests no treponémicos de floculación utilizados actualmente están en la siguiente Tabla:

Test Estandarizados (no treponémicos)
* Venereal Disease Research Laboratory (VDRL)
* Unheated serum reagin (USR)
* Rapid plasma reagin (RPR) tarjetas
de 18 mm de diámetro.
* Reagin screen test (RST)
* Toluidine red unheated serum test (TRUST)

Todos los estos tests tienen como antígeno base el de VDRL: cardiolipina, lecitina y colesterol. Se han hecho modificaciones de este antígeno con estabilizadores de la suspensión y agentes que permiten la visualización de las reacciones.
Todos los tests no treponémicos detectan inmunoglobulinas IgG e IgM antifosfolípidos, formadas como respuesta del huésped a los antígenos lipídicos de la superficie celular de los treponemas. El complejo antígeno-anticuerpo formado permanece en suspensión y la reacción
que ocurre es de floculación y no de aglutinación
o precipitación. Todos estos tests se realizan de la misma manera, el antígeno se mezcla con el suero del paciente en una placa se rota unos minutos ( esto esta especificado para cada test) y luego se procede a la lectura.
El test de VDRL y USR son test de floculación microscópica. El test de VDRL es el único estandarizado para LCR. La desventaja del VDRL frente a USR es que la suspensión antigénica debe ser preparada diariamente.
El test de RPR utiliza una suspensión estabilizada
de antígeno y partículas de carbón que quedan atrapadas en el enrejado formado por la unión antígeno-anticuerpo si el suero testeado es positivo. Se realiza en tarjetas plásticas descartables y la muestra puede ser suero calentado, sin calentar o plasma. No requiere el uso de microscopio por eso se clasifica dentro de los métodos de floculación macroscópica. Esta prueba también se adapto para ser utilizada con independencia de las instalaciones de un laboratorio, consiste en dejar caer tres gotas de sangre de un dedo sobre una depresión de la tarjeta que contiene anticoagulante y lecitina( que causa la aglutinación de leucocitos y eritrocitos). Después que las células se han separado del plasma, se toman 0.03 ml del mismo con una tubo capilar y se coloca en otra área de la tarjeta y se
le agrega 1/70 ml de suspensión de antígeno que contiene carbón, se agita manualmente durante 4 minutos y se observa la aparición o ausencia de grumos. Esta prueba se utiliza en trabajos de campo, y como prueba de screening en algunos laboratorios pero informaciones recientes la encuentran menos sensible que la RPR-18mm.
El RST( reagin screen test) en lugar de carbón utiliza para la visualización SUDAN BLACK B, el TRUST( Toluidine red unheated serum test) el pigmento nombrado reemplaza el carbón.
Si bien estos tests en tarjeta pueden usarse con suero o plasma, se recomienda el uso de suero. Si se utiliza plasma la sangre debe recogerse sobre
le anticoagulante especificado por el fabricante del reactivo y testeado dentro de las 48 horas de extraída la muestra.
Los resultados se expresan como REACTIVOS o NO REACTIVOS, la VDRL y USR
también puede expresarse como DEBIL REACTIVA. Los resultados cuantitativos se informan como la inversa de la máxima dilución reactiva, por ejemplo: 8 dils. en lugar de 1/8.

Interpretación de resultados:
Para el diagnostico de sífilis se debe realizar primero un test no treponémico.
Los resultados reactivos nos indican infección presente o pasada (que no ha sido tratada adecuadamente) y también puede ser un “falso reactivo biológico”.
El resultado no reactivo nos indica ausencia de infección o tratamiento efectivo de la infección.
El resultado no reactivo no descarta una sífilis en periodo de incubación.
Como regla general una cuadruplicación del titulo indica infección, reinfección o fracaso del tratamiento, a la inversa una disminución en cuatro veces el titulo indica buena respuesta al tratamiento. Se debe utilizar el mismo test no treponémico para el seguimiento de las muestras inicialmente reactivas. El uso de mas de un test no treponémico conduce a interpetaciones confusas de los resultados.
Se reconoce entre 1 % a 2% de falsos reactivos en
la población general independientemente del test no treponémico utilizado. Algunos de estos falsos biológicos se prolongan menos de 6 meses y su causa podría deberse a enfermedades febriles, inmunizaciones, en el embarazo. Sin embargo hay que prestar atención a estos “falsos reactivos biológicos”, ya que muchas veces están asociados
a enfermedades autoinmunes, como artritis reumatoidea, lupus eritematoso sistémico, o infecciones crónicas como lepra.
En general el 90% de los falsos positivos estan por debajo de 8 dils., pero atención que la sífilis tardía
y latente también da títulos bajos. Siempre para evaluar el valor predictivo de los tests diagnósticos hay que tener en cuenta la población que estamos estudiando( alto o bajo riesgo).
Los resultados falsos negativos por fenómeno de prozona,( se refiere a la precipitación subóptima que ocurre en presencia de exceso de anticuerpos) ocurren en 1% a2% de los pacientes con sífilis secundaria. Las muestras muestran un patrón no reactivo o una reactividad inusual. También hay falsos negativos en la sífilis tardía o en el periodo
de incubación. Si el resultado no esta de acuerdo con
al historia clínica del paciente se debe solicitar una nueva muestra para su evaluación.

• Tests treponémicos

Se reconocen tres tests treponémicos standard: FTA-abs, FTA-abs DS y MHA-TP. Todos estos utilizan Treponema pallidum como antígeno y se basan
en la detección de anticuerpos dirigido contra sus componentes.
El primer test treponémico fue desarrollado por Nelson y Mayer en 1949, Test de Inmovilización de Treponema pallidum (TPI), consiste en enfrentar suero inactivado del paciente con complemento de cobayo y una suspensión de treponemas vivos obtenidos por inoculación en testículos de conejo con cepa Nichols. . Se incuba a 35°C durante 18-24 horas en atmósfera de nitrógeno- CO2. La lectura se realiza en campo oscuro evaluándose el porcentaje de inmovilización. Se considera positiva cuando se logra un 50-100% de inmovilización. Los inconvenientes técnicos que implican el uso de los treponemas vivos fueron solucionados con el desarrollo en 1957 del test de inmunofluorescencia para anticuerpos anti treponema pallidum (FTA), donde una dilución 1:5 del suero del paciente se hace reaccionar con una suspensión de treponemas muertos fijados en un portaobjeto, luego se revela la presencia de anticuerpos con anti-gamma globulina humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína. Esta técnica daba falsos positivos en un 25% de sueros normales, esto se debe a antígenos comunes alT. pallidum y treponemas banales. Para solucionar esto se trata previamente el suero con un extracto proteico de treponemas de Reiter (sorbente) para absorber los anticuerpos de grupos presentes con el que se diluye 1:5 el suero de allí el nombre de FTA-abs. Una variante de esta técnica la constituye la FTA-abs con doble tinción (FTA-abs DS) emplea como anticuerpo revelador anti-IgG humana conjugada con isotiocianato de tetrametil rodamina
y como contraste anti-T. pallidum conjugado con isotiocianato de fluoresceína, con lo que se elimina la necesidad de examinar con campo oscuro la presencia de treponemas en el preparado. En ambos casos se informa Reactivo, Débil Reactivo y No Reactivo . Las muestras que resultaran Débil reactivas deben reexaminarse en 1 a 2 semanas
y de repetirse el resultado en ausencia de evidencia clínica de infección por T. pallidum debe informarse como equivoco. Estas reacciones requieren muchos componentes, por lo tanto las causas de error pueden ser variadas, por lo que deben controlarse especialmente: la titulación del conjugado, incluirse en los procedimientos controles reactivos, no reactivos, débil reactivo, control de inespecificidad: sorbente., también debe ser controlado las condiciones en las que opera el microscopio.
Los laboratorios que no cuentan con microscopio de fluorescencia y/o con personal entrenado para dicha técnica pueden recurrir para la confirmación de las pruebas no treponémicas a la microhemaglutinación (MHA-TP), es una técnica sencilla en la que inicialmente se trata el suero con un medio de absorción ( treponemas de Reiter y estabilizadores) luego se enfrenta en placas de microtitulación a una suspensión de eritrocitos de carnero sensibilizados con antígeno de T. pallidum, se debe agregar eritrocitos no sensibilizados como control de reactividad inespecífica.
Los resultados se informan de acuerdo al patrón de aglutinación, en presencia de anticuerpos específicos los eritrocitos aglutinan (reacción positiva), en ausencia de anticuerpos los eritrocitos sedimentan( reacción negativa).
Como todas las reacciones de aglutinación permite la cuantificación, sin embargo numerosos trabajos han demostrado la falta de correlación entre el titulo obtenido por la MHA-tp y la evolución o el estadio
de la Sífilis.

Consideraciones sobre la
aplicación de estas técnicas
Los tests treponémicos deben utilizarse para confirmar los resultados reactivos obtenidos con las pruebas de tamizaje: VDRL, USR, RPR., también para confirmar una sospecha clínica de sífilis aun cuando la reacción de tamizaje resulte negativa, como en la sífilis tardía. En general puede afirmarse que un test treponémico reactivo indica infección presente o pasada y si el mismo es no reactivo indica ausencia de infección. Para esto ultimo tener en cuenta el periodo de incubación.En general los anticuerpos para reacciones treponémicas y no treponémicas aparecen entre 1 a 4 semanas después de la lesión. Muchas pacientes mantienen sus pruebas reactivas de por vida, solo el 15% de los pacientes en los que se instauro la terapia adecuada en la sífilis primaria negativizan sus pruebas al cabo de 2 años. No deben usarse las pruebas treponémicas como tamizaje, el 1% de la población tiene resultados falsos positivos, pero atención un FTA-abs test falso positivo puede resultar en un LES, Lupus discoide o Lupus inducido por drogas. También pueden ocurrir reacciones positivas falsas en pacientes ancianos, las que no tienen explicación. Algunas reacciones falsas positivas pueden explicarse por una deficiente absorción o por la presencia de anticuerpos emparentados como los que aparecen en la enfermedad de Lyme.
La MHA-TP tiene menos falsos positivos (< 1%), pero varia en sensibilidad respecto de los tests de fluorescencia en la sífilis primaria , resultando estos últimos mas sensibles en este periodo.

Tests diagnósticos de reciente desarrollo
Hasta aquí se han expuesto los méodos serológicos standard para el diagnostico de Sífilis, están en permanente desarrollo y evaluación otros méodos que se ubican en la categoría de provisionales y de investigación, como también los que se basan en biología molecular.
La necesidad de estudiar nuevos méodos surge fundamentalmente de dos situaciones clínicas difíciles de resolver : Sífilis congénita y neurosíilis. Para mejorar el diagnostico de la primera se ha desarrollado un método de Elisa con captura de IgM del suero del paciente en fase sólida, luego se agrega antígeno purificado (T. pallidum) y anticuerpo anti-T.pallidum y streptavidina-biotina marcado con peroxidasa de rábano, luego el sustrato apropiado. Este método se comparo con FTA-abs IgM con suero pretratado para eliminar IgG y se encontró muy buena correlación. Si bien la reacción de FTA-abs IgM con suero pretratado puede ser útil como test confirmatorio, no debe usarse como test de tamizaje y aun no reemplaza el examen clínico periódico combinado con las reacciones no treponémicas seriadas para el diagnóstico del recién nacido con sífilis congénita.
Otras técnicas en investigación son el Western blot para detectar IgG e IgM. Esta ultima resulta de mayor sensibilidad para el diagnostico de Sifilis congénita.
Para neurosífilis una técnica que aun esta en etapa de investigación es la reacción de FTA-abs en LCR. Tiene mayor sensibilidad que VDRL en LCR, la causa de esta mayor sensibilidad puede ser la presencia
de anticuerpos remanentes en LCR de pacientes tratados en sifilis temprana o latente mas que
a neurosíilis. El problema en este caso reside en reconocer la presencia de infección, los tests serológicos no son en general apropiados para este fin ya que permanecen positivos en el paciente tratado . Todos los esfuerzos están dirigidos a detectar la presencia del T. pallidum en muestras
de LCR. Pero hasta el presente no fue posible diferenciar entre la presencia de un pequeño numero de treponemas viables y de spiroquetas muertas cuyo DNA puede ser amplificado.

CONCLUSION:
La mayoría de los méodos para el diagnostico de Sifilis que utilizamos han sido desarrollados hace mas de veinte años, algunos de los cuales tienen baja sensibilidad en ciertos estadios de la enfermedad, es por esto que se siguen investigando nuevas metodologías con objeto de aumentar sensibilidad y especificidad. Los méodos de biología molecular probablemente logren un avance en este sentido.


Bibliografía:
• ”Manual of Tests of Syphilis” American Public Health Association, 1990.
• “Laboratory Diagnosis and Interpretation of Tests for Syphilis”, Clin. Microbiol.Rev.Vol8, N°1.Jan 1995.
• “Enfermedades congenitales. Serología sifilítica: métodos e interpretación de resultados” Análisis Clínicos, X, 40(201-208), 1985.
• “Diagnosis of syphilis” Bulletin of the World Health Organization, 59 (5): 647-654(1981).
• “Manual de reacciones para el diagnostico de la sífilis” Organización Panamericana de la Salud, Publicación Científica N° 311, 1975. PEEC- Subprograma Inmunoserología, Dra.Liliana E.D´Agostino.