Recuperación de hongos en hemocultivos

María Fernanda Zuiani & Amadeo Javier Bava

Subprograma Micología del PEEC de Fundación Bioquímica Argentina y Cátedra de Micología & Parasitología de la Facultad de Ciencias Exactas de la UNLP.

La presencia de hongos en la sangre recibe el nombre de funguemia y los hemocultivos constituyen una herramienta de gran valor en el diagnóstico de las mismas. A pesar de los adelantos logrados, cerca del 50% de los procesos infecciosos de probada etiología fúngica, diseminados por vía hemática, quedan sin diagnóstico con los métodos actualmente disponibles (1).
Datos recientes sugieren un aumento significativo del número de fungemias. Mientras que en el pasado sólo unas pocas especies del género Candida eran esporádicamente recuperadas de los hemocultivos, ha habido un reciente incremento cualitativo de los aislamientos. Desafortunadamente, aún con la aplicación de los métodos disponibles más efectivos, muchos pacientes con enfermedades fúngicas diseminadas, graves y que ponen en peligro sus vidas, poseen hemocultivos negativos para hongos. Esto obliga a la administración de un tratamiento antifúngico empírico, provisto de múltiples inconvenientes, entre ellos, la imposibilidad de llegar al diagnóstico de certeza, la exposición a los eventuales efectos tóxicos del mismo y a la inevitable selección de cepas resistentes (2).
Entre las especies emergentes se encuentran los hongos dematiáceos, las especies de Candida diferentes de C. albicans, Fusarium, Malassezia y Zygomycetes, Trichosporon cutaneum(beigelii), Cryptococcus neoformans e Histoplasma capsulatum. Su recuperación ocurre por lo general a partir de hemocultivos de pacientes inmunocomprometidos, en los cuales las micosis son sumamente graves y la diseminación hemática es la regla. Sumado a ello, surge en el presente la aparición de cepas resistentes a los antifúngicos actualmente en uso, cuyo reconocimiento requiere de pruebas de susceptibilidad antifúngica “in vitro” (3).
El uso de la metodología de detección de bacteriemias se ha extendido al diagnóstico de funguemias. Hoy se cuenta con algunas variantes para la recuperación de patógenos fúngicos de la sangre, no obstante queda por determinar si las variables aplicadas para incrementar la eficacia de estos métodos sobre la recuperación de las bacterias influyen de igual manera sobre los hongos. Es probable que los factores críticos tales como el volumen de sangre cultivado y la relación entre el volumen de sangre cultivada y la de medio de cultivo, también influyan sobre el aislamiento de los hongos.
En la práctica diaria, el rocesamiento de los hemocultivos puede llevarse a cabo de forma manual o automatizada. El procesamiento manual de los hemocultivos se realiza en botellas conteniendo medios de cultivo líquidos o bifásicos, y la detección de los microorganismos, se realiza a través de la observación de turbidez, hemólisis, presencia de gas, de velo, de colonias, etc.
Las técnicas de laboratorio empleadas en la recuperación de hongos de la sangre ha evolucionado desde la época en que sólo se contaba con medios bifásicos (del tipo frascos de Castañeda), preparados en forma casera.
Una variedad de medios son empleados con éxito para el desarrollo de hongos en los hemocultivos, entre los cuales se encuentran los caldos de Tripteina Soja, Columbia, Tioglicolato e Infusión de Cerebro y Corazón (BHI).
Varios estudios han demostrado que la ventilación e incubación aeróbica de los frascos de hemocultivo convencionales mejoran la recuperación de los hongos. Sin embargo, la temperatura óptima de crecimiento de estos últimos varía de una especie a otra, aunque generalmente los hongos filamentosos desarrollan mejor a 28-30° C y las levaduras a 37° C. El tiempo de incubación es variable, mientras que en las levaduras puede ser de 2 a 3 días, en los hongos termodimórficos es mayor (3-6 semanas).
Existen métodos comerciales para el procesamiento manual de los hemocultivos como los sistemas cualitativos Septi-Chek, Opticult, Oxoid y el sistema de lisis-centrifugación Isolator. Los medios bifásicos han sido considerados desde un principio ideales para el aislamiento de hongos; el Septi-Chek es un medio comercial con esas características.
Los hongos filamentosos crecen en general bien sobre la superficie de los medios sólidos tales como agar BHI o agar miel y/o glucosado de Sabouraud, por lo cual un sistema que contenga alguno de estos medios debería mejorar las posibilidades de aislamiento de este tipo de hongos a partir de muestras de sangre.
El sistema de lisis-centrifugación (L-C) y sus modificaciones poseen la ventaja de que el centrifugado obtenido luego del proceso de lisis es sembrado directamente sobre cualquier medio sólido o líquido, evitando repiques y posibles contaminaciones (4).
Los sistemas automatizados emplean la detección de anhídrido carbónico por métodos radiométricos, espectrometría infrarroja, colorimetría, variaciones de presión y fluorescencia y utilizan botellas con distintas formulaciones para cultivo bacteriano aerobio y anaerobio y botellas con caldos selectivos para el desarrollo de hongos, tales como los sistemas Bactec, BactAlert, Vital, ESP80, etc (4).
Numerosos estudios han comparado la eficacia de los diferentes sistemas de hemocultivos para la recuperación de especies fúngicas. En un trabajo comparativo de un sistema manual (Septi-chek) y uno automatizado (DifcoESP) no son se observaron diferencias significativas en la detección de los aislamientos de Candida sp. (5).
En otro estudio comparativo, esta vez de dos sistemas automatizados para hemocultivos (Bactec 9240 y BactAlert/3D), se inocularon botellas que contenían caldo para cultivos bacterianos aeróbicos y de hongos, con sangre de donantes sanos y con un inóculo de 1.000 levaduras. Posteriormente se analizó el porcentaje de resultados positivos y el tiempo requerido para la detección. Con las botellas con caldo selectivo para hongos se detectaron el 100% de las levaduras en ambos sistemas, en oposición a un 95% en las botellas para cultivo bacteriano aeróbico. Por otro lado, la velocidad de detección fue mayor en el caldo selectivo para hongos (21-24 hs.) que en caldo para cultivo aeróbico (29-33 hs.). Si bien los sistemas aerobios presentaron una buena performance, hay que tener en cuenta que sólo se consideraron 5 especies del género Candida (C .albicans, C .tropicalis, C. krusei, C. glabrata y C. parapsilosis), las cuales son aisladas con mayor frecuencia en hemocultivos, y, que otros géneros que pueden ser causantes de micosis sistémicas, no fueron evaluados (6).
La comparación de las botellas con caldo para cultivo de hongos y para cultivo bacteriano aeróbico del sistema Bactec 9240, realizado sobre 550 pares de hemocultivos, mostró que las primeras fueron mejores, tanto en el porcentaje de resultados positivos como en el tiempo requerido para la detección de la funguemia. Además, las botellas con medio selectivo para hongos fueron marcadamente superiores para la detección de Candida glabrata. Ambos tipos de botellas detectaron las especies más comunes de Candida, S. cerevisiae y en un caso, a Cryptococcus neoformans, pero sólo en las botellas con medio selectivo pudieron determinarse casos de funguemias producidas por especies menos frecuentes como Rhodotorula mucilaginosa, Malassezia furfur, C. guillermondii y Fusarium proliferatum. Según este autor, el empleo de una botella con caldo selectivo para hongos en el set para hemocultivo, en pacientes de alto riesgo, si bien es más costoso, aportaría una mejora en la sensibilidad y en la detección temprana de una funguemia (7).
Los trabajos anteriores han evaluado la significación estadística de la detección de las especies más frecuentemente aisladas en hemocultivos (Candida sp.) por los sistemas automatizados, pero no de otras levaduras como Cryptococcus sp u hongos termodimórficos como Histoplasma capsulatum, debido a la menor frecuencia de funguemias provocadas por estos hongos.
En un trabajo realizado sobre 6.108 hemocultivos, se compararon las botellas con caldo selectivo para hongos del sistema Bactec con el sistema L-C, Isolator. Dos aislamientos de H. capsulatum fueron obtenidos sólo con el sistema Isolator, un aislamiento de C. neoformans fue obtenido sólo con el sistema Bactec y otro aislamiento de C. neoformans fue recuperado en los dos sistemas (8).
Un estudio encontró que los sistemas Isolator (L-C) y Bactec con sus botellas para cultivo de hongos Myco/F Lytic detectaron 18 de 19 funguemias producidas por H. capsulatum y sólo una fue detectada únicamente por Isolator, en el cual se obtuvieron 2 UFC. El tiempo de detección fue menor con el sistema Isolator e inversamente proporcional al número de UFC obtenidas. Respecto de C. neoformans, se encontró que los dos aislamientos estudiados fueron recuperados por ambos sistemas (9). En un trabajo similar, realizado por Wheat, con 70 aislamientos de H. capsulatum, el 100% de ellos fue recuperado con Isolator mientras que sólo 63 aislamientos lo fueron con el sistema Bactec con botellas que contenían caldos selectivos para cultivo de hongos. También el tiempo de detección de la funguemia fue mayor en el sistema Bactec que con el Isolator. De acuerdo a estos autores, tanto el sistema Isolator como el sistema automatizado con botellas con caldos selectivos para el cultivo de hongos serían excelentes para la recuperación de H. capsulatum y C. neoformans.
En forma general podemos concluir que los sistemas manuales y automatizados son adecuados para la detección de funguemias producidas por Candida sp., pero al momento de detectar otras levaduras, hongos filamentosos y termodimórficos, el sistema de lisis centrifugación es superior, tanto en la sensibilidad como en la velocidad de detección.
Con respecto al uso de sistemas automatizados o manuales, los primeros permiten el procesamiento de mayor cantidad de muestras en menor tiempo, lo que representa una ventaja para los laboratorios con un flujo elevado de muestras; para los laboratorios pequeños, los métodos manuales, si bien implican mayor tiempo operativo, son más económicos y ofrecen buenos resultados.
En la actualidad, existen métodos moleculares que detectan la presencia de hongos (PCR con primers o cebadores específicos para hongos) a partir de cultivos de sangre ya incubados. Entre las ventajas se pueden mencionar la reducción del tiempo de desarrollo en el subcultivo y una sensibilidad mayor que el examen directo. No obstante, debe considerarse que un resultado positivo puede deberse a la presencia de cualquier hongo que contamine la muestra. (10)
También hay metodos que contribuyen a la detección de las funguemias, como el dosaje de metabolitos y antígenos de los hongos; tal es el caso de la determinación de1,3 ß-D glucano y de mananos como screening de la presencia de hongos y de Candida, respectivamente, de galactomanano para especies de Aspergillus y de glucuronoxilomanano como marcador de la presencia de C. neoformans. (11)
La evaluación de un resultado positivo debe ser cuidadosa, ya sea que el mismo se haya obtenido por cultivos, por detección de metabolitos o de ADN, debido a que muchas de las especies ubicuas en el ambiente pueden causar infecciones graves, diseminadas por via sanguínea, en pacientes inmunocomprometidos. Entre las medidas precautorias para evitar la contaminación se encuentran la toma de muestra en forma correcta y el procesamiento de las mismas en forma apropiada y en lo posible dentro de un flujo laminar o gabinete de seguridad biológica (12).
Cualquiera que sea el sistema empleado, debe hacerse una cuidadosa correlación entre los resultados obtenidos por el laboratorio y la evaluación clínico epidemiológica del paciente. En favor de la significación del hallazgo se encuentran el resultado positivo de múltiples muestras con la misma especie fúngica, características clínicas compatibles con una micosis provocada por el hongo recuperado y la presencia en el huésped de condiciones favorecedoras para la presencia de micosis. Es de primordial importancia la comunicación fluida entre el microbiólogo y el médico a los efectos de debatir probables resultados controvertidos o no esperados.

Referencias bibliográficas

1.- O’Shaughnessy EM, Shea YM, Witebsky FG. Laboratory diagnosis of invasive mycoses. Infect Dis Clin North Am. 17: 135-158, 2003.
2.- Alexander BD. Diagnosis of fungal infection: new technologies for the mycology laboratory. Transpl Infect Dis 4 (Suppl 3): 32-37, 2002.
3.- Pfaller MA, Diekema DJ. Rare and emerging opportunistic fungal pathogens: concern for resistance beyond Candida albicans and Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol 42: 4419-4431, 2002.
4.- Reimer LG, Wilson ML, Weinstein MP. Update on detection of bacteremia and fungemia. Clin Microbiol Rev 10: 444-465, 1997.
5.- Cockerill FR 3rd, Torgerson CA, Reed GS, Vetter EA, Weaver AL, Dale JC, Roberts GD, Henry NK, Ilstrup DM, Rosenblatt JE. Clinical comparison of difco ESP, Wampole isolator, and Becton Dickinson Septi-Chek aerobic blood culturing systems. J Clin Microbiol 34: 20-24, 1996.
6.- Horvath LL, George BJ, Murray CK, Harrison LS, Hospenthal DR. Direct comparison of the BACTEC 9240 and BacT/ALERT 3D automated blood culture systems for candida growth detection. J Clin Microbiol 42: 115-118, 2004.
7.- Comparison of Mycosis IC/F and plus Aerobic/F media for diagnosis of fungemia by the bactec 9240 system. J Clin Microbiol 42: 773-777, 2004.
8.- Comparison of the BACTEC MYCO/F Lytic bottle to the isolator tube, BACTEC Plus Aerobic F/bottle, and BACTEC Anaerobic Lytic/10 bottle and comparison of the BACTEC Plus Aerobic F/bottle to the Isolator tube for recovery of bacteria, mycobacteria, and fungi from blood. J Clin Microbiol 39: 4380-4386, 2001.
9.- Evaluation of BACTEC MYCO/F Lytic medium for recovery of mycobacteria, fungi, and bacteria from blood. J Clin Microbiol 39: 2933-2936, 2001.
10.- Use of a panfungal PCR assay for detection of fungal pathogens in a commercial blood culture system.J Clin Microbiol 42: 2292-2293, 2004.
11.- Non-culture based laboratory diagnosis of sepsis. Rinsho Byori 47: 487-493, 1999.
12.- Non-culture based diagnostic tests for mycotic infections. Med Mycol 38 (Suppl 1):147-159, 2000.