Tiroxina libre (T4L) Métodos
de estudio y control de calidad

Dras. Virginia Mariano, María Ofelia Sola

Subprograma de Endocrinología. Programa de Control Externo de Calidad
Las células foliculares de la glándula tiroides sintetizan las hormonas tiroideas, tiroxina (3-5-3’-5’-tetrayodotironina o T4) y triyodotironina (3-5-3’-triyodotironina o T3). Una vez vertidas al torrente circulatorio son vehiculizadas mediante proteínas de transporte hasta los tejidos periféricos donde actúan a través de un mecanismo de acción específico regulando numerosos procesos metabólicos, y de crecimiento y diferenciación celular.
La mayor parte de las hormonas tiroideas (HT), casi el 99,9%, circulan en plasma unidas a tres proteínas de transporte y únicamente el 0,05-0,1% lo hace en forma libre. El tipo de unión entre las hormonas tiroideas y sus proteínas de transporte es reversible de modo que siempre existe un equilibrio entre la cantidad “ligada” y la “libre”.
Las pruebas bioquímicas son necesarias para el diagnóstico y seguimiento de las enfermedades tiroideas. En los últimos años se han producido avances en los instrumentos de medición, se han mejorado la sensibilidad y especificidad de los ensayos, pero todavía se observa variabilidad método a método y susceptibilidad a las interferencias.
Muchos factores pueden afectar la sensibilidad y exactitud diagnóstica y alterar las concentraciones plasmáticas de Tirotrofina (TSH) y de HT: 1) variabilidad fisiológica intrínseca 2) anormalidades genéticas en las proteínas transportadoras, 3) enfermedades severas no tiroideas (NTI) 4) agentes farmacológicos no tiroideos (por ejemplo: glucocorticoides, betabloqueantes), 5) presencia de autoanticuerpos anti-hormonas tiroideas, anti-Tg, y anticuerpos heterófilos (HAMA).
Los efectos de las enfermedades no tiroideas son frecuentes en pacientes hospitalizados y no hospitalizados que pueden ser eutiroideos o tener enfermedad hipotalámica, hipofisaria o tiroidea recurrente. Además las mediciones imprecisas y engañosas pueden confundir la evaluación bioquímica.
La determinación de T4L es un indicador más confiable del estado tiroideo cuando el estado tiroideo es inestable, como por ejemplo durante los 2 ó 3 primeros meses de tratamiento para el hipo o el hipertiroidismo. En pacientes hipotiroideos en los que se sospecha falta de cumplimiento con la terapia de reemplazo con L-T4, el seguimiento se debería realizar con ambas determinaciones: TSH y T4L, ya que estos pacientes pueden presentar valores discordantes de TSH y de T4L (TSH elevada / T4L elevada) debido a un desequilibrio persistente entre ambas.
Ver cuadro de Marcas

Cuando el ensayo discordante es la T4 libre

1) En presencia de TSH elevada y T4 libre normal, las causas probables pueden ser Hipotiroidismo leve (subclínico) no tratado, tratamiento con dosis inadecuada de L-T4, o no adhesión al tratamiento. Es conveniente determinar TPOAb y confirmar TSH después de 6 semanas, o aumentar la dosis de LT4 y aconsejar cumplir con el tratamiento.

2) En presencia de TSH disminuida y T4 libre normal o disminuida, las causas probables pueden ser hipertiroidismo leve (subclínico) o sobretratamiento con T3. Es conveniente descartar un bocio funcionante autónomo y determinar T3 libre para descartar tirotoxicosis por T3.

3) En presencia de TSH normal y T4 libre aumentada, las causas probables pueden ser alteraciones en las proteínas transportadoras, interferencias por anticuerpos (Ac anti T4, HAMA o factor reumatoideo), en consecuencia es necesario determinar T4 libre con un método alternativo, idealmente con alguno que utilice separación física por ejemplo diálisis de equilibrio o ultrafiltración. También es común observar estos resultados durante el tratamiento del hipotiroidismo, situación que debe controlarse.

4) En presencia de TSH normal y T4 libre disminuida, las causas probables pueden ser fármacos que compiten con las proteínas transportadoras, siendo necesario entonces determinar T4libre mediante un método que use dilución mínima. O podemos estar en presencia de un embarazo, donde es aconsejable utilizar un método insensible a la albúmina y usar rangos de referencia específicos para el método y para cada trimestre.

Clasificación de ensayos de T4 libre en suero

1) Métodos directos
1.1 Separación de membrana antes del inmunoensayo de T4 libre
1.1.1 Diálisis en equilibrio directo (¨diálisis directa¨)
1.1.2 Ultrafiltración directa
1.2 Inmunoensayos de T4 libre directos sin separación previa de T4 libre
1.2.1 Inmunoensayos de un paso
1.2.2 Inmunoensayos de dos pasos

2) Métodos indirectos (utilizan las mediciones de T4 total para calcular los valores de T4 libre)
2.1 Separación de membrana de 125I-T4 para estimar las fracciones libres de T4 total (T4 libre = T4 total X fracción libre):
2.1.1 Diálisis de marcadores en equilibrio (¨diálisis indirecta¨)
2.1.2 Ultrafiltración de marcadores en equilibrio (¨ultrafiltración indirecta¨)

3) Indice de T4 libre, T4 libre : T4 total/globulina fijadora de tiroxina
En los inmunoensayos de hormona libre, la disponibilidad de la hormona ligada a las proteínas para los anticuerpos del ensayo se previene o se limita cuidadosamente de modo que solo se mide la hormona libre


Se han utilizado dos configuraciones de inmunoensayos de fijación competitiva, ensayo de hormona marcada y de anticuerpos marcados. Los ensayos de hormona marcada pueden ser de dos tipos a) los ensayos que utilizan hormonas marcadas y b) los que utilizan derivados hormonales marcados que son diferentes químicamente de las moléculas de hormona nativa (análogos de hormona)
Ambos tipos de ensayos de hormona marcada utilizan anticuerpos que son inmovilizados. Los ensayos de anticuerpos marcados utilizan anticuerpos modificados para producir la señal del ensayo, con moléculas de hormonas modificadas para la inmovilización.
En ambas configuraciones, las moléculas de hormona nativa compiten con moléculas de hormona modificada para la fijación a una única población de anticuerpos. Después de un periodo de incubación, se eliminan típicamente las moléculas solubles. La señal es generada por las moléculas marcadas (hormonas o anticuerpos) en complejos binarios con moléculas inmovilizadas (anticuerpos u hormona). En los casos típicos, las señales en los inmunoensayos de fijación competitiva son inversamente proporcionales a las concentraciones de hormona. Este hecho se aplica tanto a las configuraciones de hormona marcada como de anticuerpos marcados, dado que las concentraciones elevadas de hormona nativa desplazan más hormona marcada del anticuerpo o más anticuerpo marcado de la hormona inmovilizada.
Los métodos basados en membrana, son utilizadas para separar las proteínas séricas y las hormonas ligadas a proteínas de las hormonas libres por diálisis en equilibrio o ultrafiltración para eliminar la interferencia de las proteínas en suero de los inmunoensayos de hormona libre y al mismo tiempo controlar cuidadosamente cualquier disociación de hormona libre de las proteínas que de otro modo podrían sesgar la medición de hormona libre.
Todos los métodos de diálisis en suero comprenden la dilución del suero. La T4 ligada a proteínas se disocia durante la diálisis, lo que aumenta la masa de T4 libre con el dializado hasta que la concentración de T4 libre en el dializado iguala a lo retenido. La medición de la concentración de T4 libre en el dializado por RIA en el ensayo de diálisis en equilibrio directo debe proporcionar una medida precisa de las concentraciones de T4 libre en suero. Los problemas incluyen secuestro de la hormona y dilución de los inhibidores en suero.
Los métodos de diálisis en equilibrio indirecto o de ultrafiltración se caracterizan por la contaminación con yoduro marcado de yodotironinas marcadas en el dializado y el ultrafiltrado que puede sobrestimar en forma variable los estimados de hormonas libres. No están calibrados gravimétricamente y las recuperaciones analíticas son proporcionadas a la fijación de T4 en suero.
Tanto los métodos de inmunoensayo de T4 libre directa de un paso y dos pasos son ensayos de fijación competitiva y la fijación es reversible. En los ensayos de un paso, todos los componentes que incluyen el anticuerpo, la T4 nativa y el análogo están presentes simultáneamente en la misma solución. Los anticuerpos o el análogo son inmovilizados e incluyen 1) un anticuerpo inmovilizado más dos especies de hormona, una marcada y una nativa del suero, que compiten para el anticuerpo o 2) un análogo de la hormona inmovilizada que compite por dos especies de anticuerpos, con el anticuerpo marcado soluble y el anticuerpo no marcado insoluble.
En los ensayos de dos pasos la hormona nativa y el anticuerpo inmovilizado son incubados en ausencia del análogo. Luego se agrega el análogo y se une a los sitios no ocupados de los anticuerpos.
Las interferencias con las mediciones de hormona libre pueden ser secundarias a: a) autoanticuerpos contra la hormona tiroidea humana y, b) secuestro de hormonas en el ensayo c) dilución de inhibidores de la fijación de la hormona a las proteínas en suero y d) dependencia de T4 ligada a las proteínas

Programa de Evaluación Externa de Calidad para T4 Libre: Resultados

Los programas de evaluación externa, permiten comparar el nivel de calidad metodológica de los distintos métodos. En todo proceso de medición existen limitaciones dadas por los instrumentos usados, el método de medición, el observador (u observadores) que realizan la medición. Asimismo, el mismo proceso de medición introduce errores o incertezas.
Errores estadísticos o aleatorios: La existencia de otra clase de errores llamados indeterminados o aleatorios, se revela por pequeñas variaciones en los sucesivos resultados de una serie de mediciones, aún cuando éstas sean realizadas por un mismo operador, instrumento, etc., en condiciones similares. estos errores surgen de pequeñas variaciones fortuitas en el instrumento usado, operador, método, etc.. Tienen origen en la imposibilidad de controlar todas las variables que afectan a las mediciones. De lo anterior se deduce que estos errores no son evitables ni previsibles por parte del operador; pero trabajando en condiciones controladas y tomando ciertas precauciones es posible reducir estas variaciones aleatorias en mediciones sucesivas.
El ingreso de métodos automáticos ha significado en una mejora en la calidad de los resultados y en el desempeño de los laboratorios de análisis clínicos. Uno de los objetivos del PEEC es la evaluación continuada y a largo plazo del error sistemático de los procedimientos de medida como complemento del control interno de la calidad.
Se compararon los resultados obtenidos por los participantes que utilizan los kits comerciales de mayor difusión en nuestro medio en la práctica clínica en tres niveles de concentración de Tiroxina libre (T4 libre) (g/dL). Se distribuyeron entre los participantes alícuotas de un mismo lote de suero comercial (BIO-RAD) liofilizado y se determinaron por 9 equipos comerciales la concentración de T4L de sueros correspondientes a diferentes niveles de hormona: (VER CUADRO)
Para evaluar el grado de dispersión de los resultados se aplicó tratamiento estadístico paramétrico calculando: 1) Coeficiente de Variación (cv) calculado como el cociente entre la Desviación Estándar (ds) y la Media (m), de cada grupo de laboratorio que utiliza la misma marca comercial, multiplicado por 100. 2) Se realizó un análisis de sesgo calculado como el porcentaje entre la diferencia de la Media de Consenso (Mc) y la m de cada grupo comercial en cada lote. 
En la Tabla 1 se agruparon los resultados por lote y por equipo comercial, Se muestra también la media de consenso y su desvío estándar en cada lote (Mc1 ± DS1, Mc2 ± DS2 , Mc3 ± DS3) donde se incluyen las respuestas de participantes que utilizan otra metodología y que no conforman cantidades suficientes para el correcto tratamiento estadístico.
En el lote 1, con menor concentración de T4 libre 4 de los 9 equipos comerciales, tienen un CV 15 %. En el lote 2 y 3 todos los equipos comerciales obtienen un CV 15 %.
• En la Figura 1 se muestra el análisis de sesgo obtenido en cada uno de los lotes. En todos los lotes los equipos comerciales: a) AXS, IMX, ELF , IMM y DPC obtienen sesgos negativos; b) EL1, EL2 y ACC obtienen sesgos positivos; c) ACS en el lote 1 y 2 presenta sesgo negativo y en el lote 3 sesgo positivo
• En las Figuras 2, 3 y 4 se muestran los resultados en cada uno de los lotes agrupados por marca comercial, donde cada marca comercial se representa como un rectángulo que corresponde al percentilo 25 y 75 y las barras el menor y mayor valor informado por los participantes. La línea de puntos representa la Mc. Se analizaron las diferencias estadísticamente significativas de los resultados entre todos los grupos de kits comerciales para cada uno de los lotes de sueros mediante el análisis de varianza (ANVA) y se realizaron comparaciones entre todos los métodos usando la prueba de Múltiple Rango utilizando el 95 % como límite de menor diferencia significativa, en los gráficos se represente el análisis en círculos rojos.

• En la Tabla 2 se calcularon los cv ponderado y ds
ponderado promedio de cada marca comercial y se los agrupó de menor a mayor
Los equipos automáticos de inmunoanálisis para hormonas tienen todavía ciertas limitaciones, debido tanto a insuficiencias de carácter analítico como instrumental.
En lo que respecta a insuficiencia de tipo analítico, no todos los métodos cumplen criterios de validez analítica, pues durante su evaluación se detectan problemas de optimización, como los que se derivan de 1) uso de anticuerpos inadecuados para detectar con exactitud las concentraciones de hormonas 2) la presencia de enfermedades distintas a las que se pretende diagnosticar y que inciden en resultados anómalos; 4) dosis mínima detectable menor a la estimada por la firma comercial e insuficiente para el diagnóstico de ciertas disfunciones endócrinas; 5) diferentes prácticas de calibración de métodos; 6) matrices de reactivos inadecuados; 7) imprecisión analítica alta a concentraciones hormonales clínicamente relevantes; 8) diferentes métodos pueden ser sensibles a diferentes componentes del suero; 9) tiempos de reacción antígeno-anticuerpos no optimizados; 10) existencia de compuestos endógenos o fármacos que interfieren en vitro o en vivo; 11) artefactos generados por la exposición del espécimen a condiciones inadecuadas, que reflejan cambios en la inmunoreactividad de algunos analitos medidos por tecnología inmunoquímica, etc.
Si en el curso de la monitorización de un paciente se cambia de ensayo, se deberá llevar a cabo un análisis seriado en paralelo.
El intercambio de información entre la clínica y el laboratorio es indispensable para optimizar el proceso diagnóstico y la eficiencia en el uso de los recursos técnicos y humanos. Sin la información clínica el laboratorio no podrá evaluar correctamente la validez clínica de un método analítico, y a su vez el médico sin la información del laboratorio, no podrá conocer o comprender las ventajas clínicas ni las limitaciones de los métodos analíticos. El contacto directo entre médicos y bioquímicos expertos en temas específicos del laboratorio es imprescindible si se pretende ofrecer una medicina asistencial y científica de calidad.

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