Estandarización
de la determinación de HbA1c

Dras. Virginia Mariano, María Ofelia Sola

Rahbar (1) detectó en 1969, mediante HPLC de intercambio iónico, una hemoglobina a la que denominó "banda de hemoglobina rápida" porque eluía mas rápido que la HbA0 . El hallazgo se produjo mientras estudiaba a pacientes diabéticos en la búsqueda de variantes de hemoglobina. Desde entonces se tardó un tiempo hasta que se estableció que dicha hemoglobina "rápida" eran moléculas de HbA0 que tenían unido un residuo de glucosa.
Lo que identificó Rahbar en los 60, se transformó en un marcador muy importante en el diagnóstico y tratamiento de la diabetes.
Las hemoglobinas glicadas representan fracciones menores de la hemoglobina humana que se forman por condensación no enzimática de la glucosa con las cadenas b de la HbA0. La subfracción HbA1c, es una glicación no enzimática de la HbA0 en la valina N-terminal de la cadena b.
En los años 80, se estableció mediante análisis por cromatografía de afinidad, que la fracción HbA1c aislada por HPLC de intercambio iónico en realidad contenía otras especies además de la HbA1c (hemoglobinas carbamiladas o acetiladas, etc.).

Estandarización de la determinación de HbA1c

Si bien desde su identificación se asoció la concentración de hemoglobina glicada con el grado de control metabólico de la glucemia en pacientes diabéticos -y por lo tanto de suma importancia en el seguimiento del tratamiento- no logró ser considerada firmemente de utilidad principalmente por la importante variablidad analítica demostrada por varios estudios interlaboratorios (2) (3).
En 1993 se presentaron los estudios de 9 años del Diabetes Control and Complications Trials (DCCT) que mostraron que el riesgo de desarrollo de complicaciones crónicas asociadas a diabetes estaban estrechamente relacionadas al grado de control de la glucemia medida indirectamente por la determinación de hemoglobina glicada. (4).
No obstante solo con el establecimiento de sistemas de referencia para promover la estandarización se logró optimizar el uso de la determinación de HbA1c como índice de la concentración promedio de glucosa en sangre durante los últimos tres meses, que es en término medio la vida de los eritrocitos.
El primer sistema de referencia fue desarrollado por el GHB Standardization Subcommitte que la American Association for Clinical Chemistry (AACC) conformó en 1993. El objetivo de este subcomité era desarrollar un plan de estandarización que permitiera a los laboratorios individuales relacionar sus resultados de hemoglobina glicada a aquellos generados por el método de referencia. (5) Dado que por ese entonces todavía no se disponía de HbA1c pura, no existía Método de Referencia Primario. En realidad, el método desarrollado por el DCCT es un Método Designado para Comparación. Estos métodos son métodos transitorios que se designan como referencia cuando no existen materiales puros o cuando el analito es inestable o heterogéneo. En ese momento no se disponía de HbA1c pura y además es una analito heterogéneo puesto que la glicación puede ocurrir al menos en 44 posiciones distintas. (6). El método DCCT basado en HPLC con intercambio iónico con BioRex 70 fue tomado como método de referencia por el Nacional Glycohemoglobin
Standardization Program (NGSP) en USA. Programas similares se establecieron en Suecia basado en una cromatografía de intercambio iónico muy específica (Mono S) y en Japón basado en el consenso de los dos fabricantes líderes en el tema.
Casi simultáneamente (1994) se forma el IFCC Working Group for Standardization of HbA1c. Este grupo se propone desarrollar un Sistema de Referencia con trazabilidad al sistema SI para lo cual necesita definer el analito, preparación de HbA0 y HbA1c puras para luego desarrollar un método de referencia. En este contexto el analito se define como hemoglobina glicada en la valina N-terminal (b-N-(1-deoxy)-fructosil-hemoglobina y se obtiene en estado puro como material de referencia (7) El método de referencia se basa en el clivaje por acción de la endoproteinasa Glu-C del hexapéptido N-terminal tanto glicado como no glicado. Estos se separan y cuantifican para lo cual hay dos alternativas: a) HPLC seguido de Espectrometría de Masa o b) HPLC seguido de Electroforesis Capilar. Ambos procedimientos dan idénticos resultados (8).


• En la Fig 1 se observa el esquema del método.

El Método de Referencia desarrollado por IFCC fue validado por un grupo de 16 laboratorios de referencia internacionales.
Este método entrega valores mas bajos que el método DCCT, precisamente por ser mas específico y trazable a un material de referencia primario. De grandes estudio comparativos entre ambos métodos se obtiene la siguiente relación, conocida como la ecuación maestra que permite transformar los resultados de un método en el otro. La ecuación de regresión entre ambos métodos y el gráfico se observan en la Fig. 2.

Figura 2. Recta de regresión de los valores de NGSP sobre los valores de IFCC.Figura 2. Recta de regresión de los valores de NGSP sobre los valores de IFCC.

La industria actualmente produce métodos trazables al método DCCT. Después del desarrollo del Sistema de Referencia de IFCC, hay un alto grado de consenso en que los calibradores sean trazables a este último, para lo cual la industria tiene la gran responsabilidad de producir calibradores y controles compatibles con el método IFCC.

Principios metodológicos disponibles para determinar HbA1c

Básicamente existen tres principios analíticos que con sus variantes están ofrecidos al laboratorio clínico, tal como puede verse en la siguiente Tabla1.

El método de intercambio iónico en microcolumnas separa las variantes de hemoglobina por la carga eléctrica. La resina de intercambio catiónico (cargada negativamente) atrae a la hemoglobina cargada positivamente. El tampón utilizado para eluír tiene un pH y fuerza iónica seleccionado de forma que las hemoglobinas glicadas se cargan menos positivamente que la HbA0 y por lo tanto al no unirse fuertemente a la resina, eluye primero. En todos los métodos de intercambio iónico es imortante controlar la temperatura de los reactivos y la columna para obtener resultados reproducibles.
El método basado en cromatografía de afinidad separar las hemoglobinas glicadas mediante la unión de los grupos cis-dioles de la glucosa a la matriz fija que contiene Acido m-aminofenilboronico. No retiene a la hemoglobina no glicada, pero retiene a todas las formas glicadas.
El método inmunológico, los métodos se basan en el uso de anticuerpos contra el producto de Amadori (unión cetoamina) mas varios aminoácidos del extremo N-terminal de la cadena b. Variantes de este método lo configuran el método inmunoturbidimétrico y el de inhibición de aglutinación de partículas de latex. Este principio no detecta otras hemoglobinas glicadas (HbA1a o HbA1b) ni variantes de hemoglobina tales como HbS, HbF, etc.

PEEC - Hemoglobina glicada

El uso de la determinación de HbA1c para el diagnóstico y seguimiento de la diabetes va en creciente aumento, impulsado por los programas de estandarización que a través de la industria están teniendo un impacto en el manejo de esta enfermedad. El laboratorio clínico juega un papel fundamental tanto en el diagnóstico como el tratamiento de la diabetes y por lo tanto es necesario que los laboratorios tengan prestaciones analíticas con el nivel de calidad adecuado para optimizar el cuidado de los pacientes diabéticos. Con este fin, el Programa de Evaluación Externa de Calidad de la Fundación Bioquímica Argentina ha puesto en marcha este año 2005 el PEEC-HbA1c. Mediante este programa se conocerá en detalle los principios analíticos utilizados por los laboratorios en todo el país, así como una medida de las prestaciones de los mismos. Hasta este momento se ha realizado una distribución de materiales de control con valores de referencia por el método de DCCT. Dado la disparidad de métodos en el mercado de productos de Diagnóstico In Vitro, este tipo de programa es de fundamental importancia para visualizar cuales son los métodos que mejor prestaciones entrega.
El PEEC-HbA1c está abierto a inscripción para las futuras distribuciones para lo cual se puede solicitar la inscripción a : Programa de Evaluación Externa de Calidad, Calle 60 Nº 537, 1900 La Plata. TE: 0221-4231150; FAX: 021-4232021 y correo-e: secpeec@fbpba.org.ar

1. Rahbar S, Blumenfeld O, Ranney HM:
"Studies of an unusual haemoglobin in patients with diabetes mellitus". Biochem Biophys Res Commun. 1969 Aug 22:36(5): 838-43
2. Mosca A, Palari R, Trapolino A, Capani F, Pagano G, Plebani M. : "A re-evaluation of glycohemoglobin standardization: the Italian experience with 119 laboratories and 12 methods". Eur J Clin Chem Clin Biochem 1997; 35:243-8
3. Weykamp CW, Penders CG, Petersen PH: "A comparison of analytical goals for haemoglobin A1c assays derived using different strategies" Ann Clin Biochem 1991; 28:272-278
4. DCCT Research Group. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med 1993;329:977-86.
5. DCCT Research Group. Feasibility of centralized measurements of glycated in the Diabetes Control and Complications Trial: A multicenter study. Clin Chem 1987;33:2267-71.
6. Kor Miedema, conferencia: Worldwide standardization of HbA1c. 10th Asian Pacific Congress of Clinical Biochemistry, Perth, Australia 2004 en www.ifcc.org
7. Finke et al.: Preparation of a candidate primary reference material for the international standardisation of HbA1c. Clin Chem Lab Med 1998; 36:299-308
8. Jan-Olof Jeppsson, Uwe Kobold, John Barr, Andreas Finke, Wieland Hoelzel, Tadao Hoshino, Kor Miedema, Andrea Mosca, Pierluigi Mauri, Rita Paroni, Linda Thienpont, Masao Umemoto and Cas Weykamp: Approved IFCC Reference Method for the Measurement of HbA1c in Human Blood. Clin Chem Lab Med 2002; 40(1):78-89

FE DE ERRATAS

• Artículo del mes de Mayo debía decir:
PEEC-Bacteriología
Dra. Venegoni Graciela
Dra. Lopreto Carmen
Dra. Altschuler Marta

Título del artículo: Bacillus, especies consideradas patógenos potenciales o contaminantes.