Seguimiento
de la infección por VIH-1:
El aporte de los métodos moleculares de cuantificación viral
Fernando Raibenberg
fraiben@fibertel.com.ar
En pacientes infectados con el virus VIH-1 durante la fase
de infección primaria, un elevado aumento de la viremia es seguido
de un estado asintomático. Esta fase de latencia se caracteriza
por cantidades de viriones y células infectadas constantes en circulación
que pueden permanecer durante largos periodos de tiempo (10) y que progresaran
hacia el desarrollo del estado patológico denominado SIDA. Una
variedad de marcadores inmunológicos y virales han sido utilizados
en un intento de obtener información sobre la historia natural
de la infección por VIH-1 para evaluar la eficacia de tratamientos
antivirales y vacunas (2).
El monitoreo de linfocitos CD4 por citometria uno de los métodos
mas utilizados, no es un buen marcador utilizado para monitorear la respuesta
clínica a una terapia antiretroviral (1,2,3,4.). La proteína
viral p24 codificada por el gen de VIH-1 gag, es una de las primeras moléculas
virales detectables en la circulación de pacientes infectados y
también se ha utilizado como marcador de progresión de la
enfermedad. A pesar que la correlación entre la antigenemia p24
en sangre y estado de la enfermedad ha sido bien establecida, (7) la no
detección en personas seropositivas para VIH-1 en fase asintomática,
e incluso en pacientes sintomáticos limita su uso (5,6,8). En el
caso de los cultivos que toman bastante tiempo, asimismo se presentan
inconvenientes similares.
El reconocimiento de las limitaciones del uso de estos marcadores en pruebas
clínicas de antiretrovirales ha generado la necesidad de validar
medidas mas certeras para el monitoreo de los niveles de replicación
viral en individuos infectados.
La determinación del nivel de virus VIH-1 en el plasma de personas
infectadas sirve como indicador de la carga viral total y se utiliza como
marcador de la progresión clínica de la enfermedad, y monitoreo
de la eficacia de un tratamiento antiretroviral (TARV) (9,11).
Los métodos moleculares de cuantificación viral, que aporta
la biología molecular, constituyen un recurso técnico valioso
y de uso permanente en el campo de la infectología particularmente
en el seguimiento de la infección por VIH. Actualmente los estudios
por carga viral están fundamentalmente indicados para, predecir
la progresión clínica de la infección VIH-SIDA, para
el monitoreo del tratamiento con antiretrovirales, y determinar así
la eficacia de la terapéutica, además sirve para estimar
el riesgo de transmisión, especialmente la materno fetal.
Los métodos moleculares de cuantificación de la replicación
viral del VIH-1 in vivo incluyen, PCR cuantitativa, la prueba NASBA (nucleic
acid sequence-based amplification) y el bDNA (branched DNA) de amplificación
de señal.
Estas metodologías se usan para cuantificar específicamente
cantidades de ARN VIH-1 presentes en las partículas virales circulantes
en el plasma pero difieren en los métodos y características
de desempeño (14).
Existen tres ensayos comerciales para la
cuantificación del ARN HIV-1 en plasma humano, disponibles en nuestro
mercado:
(ver figura 1)
(Ver figura
2)
• RT-PCR: AMPLICOR HIV-1 MONITOR (V1.5, COBAS) (Roche
Diagnostics).
• NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification)
Amplificación isotérmica de ARN: NUCLISENS HIV-1 RNA QT
(bioMerieux).
• bDNA Amplificación de señal por hibridación
molecular: VERSANT HIV-1 RNA 3.0 ASSAY (Bayer Diagnostics).
Mientras que las dos primeras están basadas en la amplificación
del ARN del VIH-1 la última no amplifica el ARN sino que amplifica
la señal obtenida mediante sondas de oligonucleótidos (b-DNA).
Cada una de ellas utiliza técnicas de detección diferentes.
El test de NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) se fundamenta
en una trascripción y amplificación coordinada por tres
enzimas; transcriptasa reversa (RT), RNasa H, y T7 RNA polimerasa. La
reacción de retrotranscripcion se lleva a cabo sobre la muestra
y los calibradores mezclados, dando lugar a ADNc de doble cadena; toda
la amplificación se realiza a una misma temperatura de 42ºC
(isotermica), uno de los primers contiene una secuencia promotora necesaria
para la reacción de la ARN-polimerasa T7 que sintetiza ARN a partir
de ADNc. Cada muestra se procesa con tres controles o calibradores internos
presentes a concentraciones diferentes (100, 10 y 1) que se diferencian
entre si y del ARN amplificado del VIH-1 en 20 nucleótidos. La
detección se basa en la emisión de luz por parte de átomos
de rutenio unidos al ARN amplificado, (electroquimioluminiscencia) que
se cuantifica y extrapola sobre una recta obtenida a partir de la emisión
de los calibradores.
El test Amplicor HIV-1 monitor V 1.5 como NASBA es un método de
amplificación de ácidos nucleicos específicos pero
en este caso en vez de ARN se amplifica ADN. Mediante una mezcla lítica
se aísla el ARN presente en el plasma y se precipita. En esta fase
se introduce, junto al reactivo de lisis, un número conocido de
moléculas de ARN (QS) que sirven como Standard para la cuantificación.
El QS es una molécula no infecciosa de ARN VIH-1 transcrita in
Vitro, de 219 pares de bases con regiones complementarias a las de las
secuencias de los primers utilizados. Dando lugar a un producto de amplificación
idéntico en bases al del VIH-1 pero cuya región de hibridación
a las sondas es diferente, lo que permite diferenciar entre los productos
del QS y los amplicones productos de la presencia del VIH. A partir del
ARN se obtiene ADNc (ADN copia). La técnica detecta y amplifica
una secuencia 155 pares de bases (correspondiente a una región
del gen gag del VIH-1 que tiene unos 1.500 nucleótidos y que codifica
antígenos específicos de grupo o las proteínas estructurales
centrales del virión). Para la amplificación por RT-PCR
se utiliza la enzima polimerasa recombinante de Thermus thermophilus rTth
(ADN-polimerasa termoestable obtenida por ingeniería genética)
que en condiciones adecuadas (presencia de manganeso) tiene actividad
como transcriptasa reversa y ADN-polimerasa. Se utilizan los primers SK145
y SKCC1B biotinilados en la mezcla de reacción de RT-PCR, que hibridan
específicamente con el ARN del VIH-1 y el QS. La rTth polimerasa
elonga el primer reverse hibridado para sintetizar una hebra de ADNc.
La mezcla de reacción se calienta y se desnaturalizan el híbrido
de ARN y ADNc. Tras el primer ciclo, cuando se enfría la mezcla,
el primer forward se híbrida con la hebra de ADNc, sufre la elongación
por la polimerasa y se sintetiza así una segunda hebra de ADN.
Por lo tanto se ha obtenido una copia doble cadena de ADNc de la secuencia
de cada ARN del VIH-1 y del QS. Un nuevo proceso de termociclado separa
el ADN bicatenario y expone la secuencia a los primers, que al enfriarse,
hibridan con el ADN y la rTth elonga los primers hibridados a lo largo
de la secuencia blanco, sintetizando una nueva molécula doble cadena
de 155 pares de bases correspondiente a la secuencia codificante del gen
gag VIH-1. En sucesivas repeticiones del proceso (35 ciclos) tiene lugar
la duplicación cada vez de la cantidad de amplicones.
El empleo de AmpErase (uracil-N-glicosilasa) y UTP permiten amplificar
selectivamente el ADNc ya que los amplicones con desoxiuridina son destruidos
antes de iniciar la amplificación del ADN blanco evitando así
la contaminación por carry over. (El ADN natural no tiene desoxiuridina,
por lo tanto los existentes son contaminantes; al ser inactiva a más
de 55 grados la uracil-N-glicosilasa no destruye los amplicones blanco
que se obtienen en los sucesivos pasos de la amplificación). Los
productos amplificados se hibridizan con sondas oligonucleotídicas
específicas. Los amplicones del VIH-1 y del QS se desnaturalizan
químicamente a ADN monocatenario mediante una solución desnaturalizante
y se pasan a una micro placa de EIA con pocillos cubiertos por sondas
oligonucleotídicas específicas para el VIH-1 (SK102) y el
QS (CP35). Los amplicones del VIH-1 y QS se unen en los pocillos mediante
hibridación con las sondas. Después de la hibridación
en la micro placa, ésta se lava para eliminar el material no fijado
y se continúa como cualquier otro EIA. El grado de color, densidad
óptica (DO), de cada pocillo es proporcional a la cantidad de amplicón
presente. El número de copias se obtiene aplicando una fórmula:
cociente entre la DO total para el VIH-1 y DO total para el QS, multiplicado
por el número de moléculas del QS introducido.
En el ensayo bDNA (branched DNA o ADN ramificado) el material inicial
son los viriones y no el ARN plasmático total. A diferencia de
las anteriores no utiliza controles internos para cada muestra sino que
se emplean para todas las muestras procesadas a la vez. El ácido
nucleico extraído se fija en una microplaca que contiene sondas
específicas y, sobre el ARN que se une, se fijan sondas de ADN
con 15 ramificaciones, a cada una de las cuales se unen 3 sondas marcadas
capaces de emitir luz al añadir un sustrato. Por cada molécula
de ARN se unen cerca de 1.800 moléculas emisoras de luz y los datos
se interpretan en función de las lecturas de los controles, cuya
concentración es conocida. Las muestras se procesan por duplicado;
si sus resultados tienen un coeficiente de variación mayor del
30% se desecha el resultado.
Mientras que las técnicas de bDNA y RT-PCR sólo se hacen
con plasma, NASBA puede realizarse con plasma, suero, sangre total, semen,
orina o líquido cefalorraquídeo. Existen variantes de todas
las pruebas, en versiones mejoradas, que tienen mayor sensibilidad, es
decir son capaces de detectar un menor número de copias/ml según
el tipo de procesamiento. Estas metodologías difieren como se ha
descrito anteriormente en los métodos de amplificación y
detección empleados, así como también en los volúmenes
de muestras que se deben procesar, y tipo de procesamiento. Igualmente
se observan diferencias entre ensayos con respecto a los resultados y
a los subtipos que cubren. Cada método tiene sus ventajas y desventajas,
por lo tanto, probablemente no existe un test capaz de resolver mejor
todas las situaciones (12,13).
Algunos estudios demostraron que la calidad de los estudios diagnósticos
moleculares requieren constante control, seguimiento y mejoramiento(15,16).
Surge entonces la necesidad de establecer un programa de garantía
de calidad para los laboratorios de diagnostico y seguimiento de la infección
por VIH-1. El programa de Evaluación Externa de Calidad PEEC-VIH
se propone llevar adelante dicho proyecto que incluye, entre otros la
distribución de paneles de control de calidad para la amplificación
y cuantificación de ácidos nucleicos del genoma del VIH-1.El
objetivo de este estudio será evaluar el desempeño en la
detección y cuantificación del ARN viral VIH-1 a través
de los métodos moleculares utilizados, por los laboratorios de
diagnóstico participantes.
Referencias:
1.- Lange, J. M. A., F. de Wolff, and J. Goudsmit. 1989. Markers for progression
in HIV infection. AIDS 3:153-160.
2.- Tsoukas, C. M., and N. F. Bernard. 1994. Markers predicting
progression to human immunodeficiency virus-related disease. Clin. Microbiol.
Rev. 7:14-28.
3. Phillips, A. N., C. A. Lee, J. Elford, G. Janossy, A.
Timms, M. Bofill, and P. B. A. Kernoff. 1991. Serial CD4 lymphocyte counts
and development of AIDS. Lancet 337:389-392.
4.- Katzenstein, D. A., M. Holodniy, D. M. Israelski, S.
Sengupta, L. A. Mole, J. L. Bubp, and T. C. Merigan. 1992. Plasma viremia
on human immunode- ficiency virus infection: relationship to stage of
disease and antiviral treatment. J. Acquired Immune Defic. Syndr. 5:107-112.
5.- Goudsmit, J., F. De Wolf, D. A. Paul, L. G. Epstein,
J. M. A. Lange, W. J. A. Krone, H. Speelman, E. C. Wolters, J. van der
Noordaa, J. M. Oleske, H. J. van der Helm, and R. A. Couthino. 1986. Expression
of human immunode - ficiency virus antigen (HIV-Ag) in serum and cerebrospinal
fluid during acute and chronic infectio n. Lancet ii:177-180.
6.- Lange, J. M. A., D. A. Paul, H. G. Huisman, F. de Wolf,
H. van den Berg, R. A. Couthino, S. A. Danner, J. van der Noordaa, and
J. Goudsmit. 1986. Persistent HIV antigenaemia and decline of HIV core
antibodies associated with transition to AIDS. Br. Med. J. 293:1459-1462.
7.- Paul, D. A., A. L. Falk, H. A. Kessler, R. M. Chase,
B. Blaauw, and D. S. Chudwin. 1987. Correlation of serum HIV antigen and
antibody with clinical status in HIV infected patients. J. Med. Virol.
22:351-363.
8.- Lelie, P. N., H. W. Reesink, E. Bakker, J. G. Huisman,
and J. Ten Veen. 1988. Clinical importance of HIV antigen and anti-HIV
core markers in persons infected with HIV. N. Engl. J. Med. 318:1204-1205.
9.- Saag, M. S., M. Holodniy, D. R. Kuritzkes, W. A. O'Brien,
R. Coombs, M. E. Poscher, D. M. Jacobsen, G. M. Shaw, D. D. Richman, and
P. A. Volderbing. 1996. HIV viral load markers in clinical practice. Nat.
Med. 2:625-629
10.- Pan, L.-Z., A. Werner, and J. A. Levy. 1993. Detection
of plasma viremia in human immunodeficiency virus-infected individuals
at all clinical stages. J. Clin. Microbiol. 31:283-288.
11.- Mellors, J. W., C. R. Rinaldo, Jr., P. Gupta, R. M.
White, J. A. Todd, and L. A. Kingsley. 1996. Prognosis in HIV-1 infection
predicted by quantity of virus in plasma. Science 272:1167-1170
12.- Revets, H., D. Marissens, S. de Wit, P. Lacor, N.
Clumeck, S. Lauwers, and G. Zissis. 1996. Comparative evaluation of NASBA
HIV-1 RNA QT, AMPLICOR-HIV Monitor, and QUANTIPLEX HIV RNA assay, three
methods for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA
in plasma. J. Clin. Microbiol. 34:1058-1064.
13.- Lin, H. J., L. Pedneault, and F. B. Hollinger. 1998.
Intra-assay performance characteristics of five assays for quantification
of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol.
36:835-839
14.- Hodara, V., A. Monticelli, S. Pampuro, H. Salomón,
H. Jauregui Rueda, and O. Libonatti. 1998. HIV-1 viral load: comparative
evaluation of three commercially available assays in Argentina. Acta Physiol.
Pharmacol. Ther. Latinoam. 48:107-113
15.- Schuurman R, Descamps D, Weverling GJ, Kaye S, Tijnagel
J, Williams I, van Leeuwen R, Tedder R, Boucher CAB, Brun-Vezinet F, Loveday
C, 1996. Multicenter Comparison of Three Commercial Methods for Quantitation
of Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA in Plasma. J Clin Microbiol;
34 : 3016-3022
16.- Yen-Lieberman B, Brambilla D, Jackson B, Bremer J,
Coombs R, Cronin M , Herman S, Katzenstein D, Leung S, Lin HJ, Palumbo
P, Rasheed S, Todd J, Vahey M, Reichelderfer P. Evaluation of a quality
assurance program for quantitation of human immunodeficiency virus type
1 RNA in plasma by the AIDS Clinical Trials Group Virology laboratories.
J Clin Microbiol (1996); 34 : 2695-2701
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