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Bacterias adaptadas al frío - PARTE II
El Comité de Redacción de Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana ha seleccionado este artículo publicado en la Revista CIENCIA HOY, Volumen 17 Nº 99 – JUNIO/JULIO 2007, para su difusión a través de FABA Informa

Ricardo M Comerio.
Departamento de Química Orgánica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, UBA
Marcelo Tarapow
Armada Argentina. Rompehielos Almirante Irizar. Susana C Vázquez CONICET.
Walter P Mac Cormack .
Departamento de Biología. Instituto Antártico Argentino

El trabajo en el laboratorio

El aislamiento y la purificación de bacterias a partir de muestras ambientales requieren la aplicación de metodologías pautadas en función del grupo bacteriano que se desee estudiar. Cuando se trabaja con comunidades de microorganismos, generalmente sólo una fracción minoritaria (entre el 0,1 y el 10%) puede ser cultivada en medios artificiales. La detección e identificación de los organismos no cultivables requieren de técnicas moleculares que permitan el aislamiento y purificación de sus ácidos nucleicos y la secuenciación de ciertos genes que se utilizan como marcadores moleculares y que, bajo ciertas condiciones, permiten también inferir relaciones filogenéticas. Cuando el objetivo es el estudio de microorganismos cultivables que se encuentran en muy baja proporción en la muestra original, conviene realizar cultivos de enriquecimiento. Para esto se utilizan medios de cultivo líquidos que mediante alguna estrategia de selección (composición química, temperatura de incubación, etc.) permitan la proliferación hasta niveles detectables de los microorganismos que se desea aislar. Si además se buscan microorganismos con alguna actividad metabólica o característica particular, para ‘ponerlos en evidencia’ debemos hacer que nuestros medios sean diferenciales, es decir que nos permitan detectar de alguna manera la presencia de la estructura o actividad buscada.

Aislamiento de bacterias marinas sicrófilas

Para la búsqueda de bacterias marinas sicrófilas, enriquecimos nuestras muestras en estos microorganismos utilizando medios de cultivo líquidos preparados con agua de mar diluida al 75%, previamente esterilizada por filtración, e incubamos los cultivos de enriquecimiento a 4 °C. El paso siguiente consistió en aislar las bacterias en cultivos puros. Para esto, transferimos asépticamente alícuotas del material previamente enriquecido a la superficie de un medio sólido en una caja de Petri,
estriándolo a fin de obtener colonias aisladas. La composición del medio sólido fue la misma que la del medio líquido pero adicionado con un 1,5% de agar-agar como agente gelificante. luego de dos pasajes sucesivos en medio sólido, transferimos cada colonia aislada a sendos tubos con medio líquido que se incubaron a 20 °C y 4 °C, respectivamente. La figura 3 ilustra el trabajo de aislamiento y purificación mencionado. Muchos de los aislamientos no resultaron sicrófilos estrictos, es decir, la mayoría de los cultivos desarrollaron a 4 °C, pero también a 20 °C. De todos modos, hemos aislado sicrófilos estrictos, principalmente del agua de mar superficial (en contacto con hielo marino), de la escarcha asociada al hielo marino y de los sedimentos obtenidos del fondo marino. Algunos de los nuevos aislamientos resultaron ser bacilos y espirilos con reacción negativa a la coloración de Gram que, como algunos de los microorganismos previamente aislados en condiciones similares, presentaron vesículas gaseosas en su citoplasma. Diversos estudios bioquímicos y moleculares que se están realizando actualmente permitirán dilucidar la identidad de estos microorganismos, ubicarlos taxonómicamente y analizar posibles aplicaciones biotecnológicas emergentes de sus adaptaciones al ambiente extremo antártico. A continuación comentamos un ejemplo de estos estudios.



• Figura 3: Esquema de trabajo para el aislamiento y purificación de bacterias sicrófilas estrictas cultivables en el laboratorio del rompehielos ARA Almirante Irízar.

Obtención de bacterias antárticas productoras de proteasas activas
a baja temperatura

Como se señaló anteriormente, uno de los objetivos planteados dentro del estudio de las bacterias sicrófilas (tanto estrictas como facultativas o sicrotolerantes) es la obtención, a partir de diversos ambientes antárticos, de cepas productoras de diferentes tipos de enzimas con actividad catalítica a bajas temperaturas. Estas enzimas podrán ser utilizadas en diversos procesos industriales en forma directa o bien podrán ser modificadas genéticamente para que conserven las propiedades deseadas y mejoren en aquellos aspectos en los cuales no son adecuadas (reducir su termosensibilidad, por ejemplo).
En los últimos tiempos, nuestro grupo de trabajo ha centrado su atención en las enzimas proteolíticas de bacterias sicrófilas, ya sea estrictas o sicrotolerantes. Estas enzimas han cobrado un gran interés en variados campos de la industria y especialmente para el desarrollo de jabones y detergentes aptos para un lavado eficiente a temperaturas menores a las utilizadas hasta el momento. El creciente uso de fibras sintéticas así como la necesidad de reducir el consumo de energía en los procesos de lavado, tanto a escala industrial como doméstica, han impulsado este interés. Existen otros campos de aplicación para estas enzimas, tales como la industria alimenticia (fabricación de galletas, lácteos, preparados proteicos) y la del cuero (proceso de ablandado), donde su utilización a temperatura ambiente podría determinar una importante reducción en los costos del proceso.
Durante cuatro campañas antárticas de verano y siguiendo un protocolo de aislamiento similar al indicado en la figura 3 (pero conservando para su análisis tanto los sicrófilos obligados como los sicrotolerantes) se obtuvieron 123 aislamientos que mostraron actividad proteolítica cuando se cultivó a las bacterias en medios nutritivos agarizados suplementados con leche descremada. En estas condiciones de cultivo, la producción de proteasas extracelulares se detecta por la presencia de un halo translúcido alrededor de la colonia, causado por la hidrólisis de la proteína ‘caseína’ presente en la leche (figura 4). Los estudios realizados han abarcado la caracterización e identificación de las bacterias, la influencia de la temperatura de aislamiento sobre las características de las proteasas producidas, la cinética de crecimiento y producción de proteasas en cultivos líquidos y aireados y la caracterización de las proteasas producidas por algunos de los aislamientos. Para esto último se purificaron por cromatografía de intercambio iónico las proteasas presentes en el sobrenadante de los cultivos líquidos después de centrifugarlos a alta velocidad y separar las células, y se estudió cómo se afectaba la actividad proteolítica por la temperatura, diferentes pH (ácidos, neutros y alcalinos), presencia de sustancias inhibidoras de proteasas y presencia de metales pesados. Esto se hizo exponiendo a las proteasas (disueltas en una solución tampón o ‘buffer’) a las diferentes condiciones por diferentes tiempos, y luego midiendo la actividad proteolítica por medio de su capacidad de hidrolizar un sustrato (azocaseína) que al ser degradado produce un color anaranjado cuya intensidad de color, proporcional a la cantidad de sustancia degradada y a su vez al nivel de actividad proteolítica presente, se mide en un espectrofotómetro a 340 nm de longitud de onda. Cuando se analizaron las características de las cepas bacterianas obtenidas se observaron diferentes morfologías (figura 4). La mayoría de estos aislamientos antárticos proteolíticos correspondían a bacilos Gram negativos capaces de utilizar glucosa en aerobiosis pero incapaces de fermentarla (76%), lo que coincide con lo encontrado en general para la flora bacteriana antártica. Al estudiar la influencia de los tres diferentes rangos de temperatura en los que se habían incubado los cultivos para realizar los aislamientos de las bacterias proteolíticas (4-6 °C, 10-13 °C y 18-20 °C) se observó que independientemente de la temperatura a la cual se aislaron, todos los aislamientos proteolíticos fueron sicrotolerantes, confirmando la ventaja adaptativa que este tipo de microorganismos tiene sobre los sicrófilos estrictos en la mayoría de los ambientes antárticos, especialmente cuando se exploran biotopos que sufren cambios estacionales de temperatura. Sin embargo, lo que se observó es que, independientemente de su eficiencia de producción o del comportamiento de sus enzimas frente a la temperatura, estos microorganismos sicrotolerantes y productores de proteasas se encuentran presentes tanto en ambientes terrestres como marinos. Estos últimos, además, soportan elevadas concentraciones de sal (superiores a los 35 g/l característicos del agua de mar) y por lo tanto sus proteasas extracelulares también pueden actuar en soluciones con mayor cantidad de sales, característica interesante para sus aplicaciones industriales.

• Figura 4: Detección de la producción de proteasas en placas de Petri que contienen un medio de cultivo sólido con leche descremada. Las colonias de bacterias productoras de proteasas presentan un halo claro de hidrólisis alrededor, producto de la degradación de la caseína (proteína de la leche) por parte de las proteasas secretadas al medio. Aunque todas ellas producen proteasas extracelulares, las bacterias que forman estas colonias pertenecen a distintos grupos taxonómicos y presentan diferentes morfologías, como puede apreciarse en las microfotografías electrónicas.

De entre todos los aislamientos, se seleccionaron para estudios más profundos dos grupos: aquellos que eran los mejores productores y aquellos que, no teniendo niveles tan altos de producción, sintetizaban las proteasas con más baja temperatura óptima para su actividad. La aplicación de métodos de identificación clásicos, combinados con la secuenciación parcial del gen codificante del ARNr 16S, mostró que todas las cepas seleccionadas pertenecían al mismo grupo (Proteobacteria, clase Gamma-proteobacteria) y se encontraron representantes de tres géneros: Pseudomonas (el más representado), Stenotrophomonas y Pseudoalteromonas (Ver figura 5 en trabajo original).

Se observó también que los rangos de temperatura utilizados para el aislamiento de las cepas ejercieron una gran influencia sobre la temperatura óptima de actividad de las proteasas producidas. Así, la menor temperatura óptima encontrada (40 °C), fue observada solo en el 14% de las cepas aisladas a 18-20 °C, en el 28% de las aisladas a 10-13 °C y en el 46% de las aisladas a 4-6 °C. Puede llamar la atención que la menor temperatura óptima de las enzimas estudiadas sea de 40 °C. Esto señala que si bien estos organismos han desarrollado estrategias diversas para vivir a baja temperatura, esta adaptación es parcial y muchas de sus enzimas trabajan a temperaturas subóptimas, ya que 40 °C es una temperatura que estas bacterias jamás encontrarán en los ambientes en donde habitan. De todas maneras, las proteasas obtenidas de estas bacterias mostraron sistemáticamente altos porcentajes de retención de su actividad a temperaturas inferiores a 20 °C así como valores de energía de activación entre 10 y 20 kJ/mol inferiores a los observados para las proteasas provenientes de microorganismos mesófilos relacionados, lo que muestra su adaptación al ambiente permanentemente frío, compensando así los problemas de la baja energía cinética presente en el ambiente.
Las enzimas obtenidas de las cepas seleccionadas por presentar temperatura óptima de actividad a 40 °C, presentaron curvas de actividad relativa en función de la temperatura desplazadas hacia la izquierda en comparación con algunas proteasas actualmente comercializadas, provenientes de organismos mesófilos (Ver figura 6 en trabajo original). Esta adaptación a trabajar a temperaturas menores fue acompañada por una importante termosensibilidad, ya que como puede observarse en la misma figura, las enzimas perdieron drásticamente su actividad a temperaturas superiores a la óptima.
Las propiedades de las proteasas de estos organismos sicrófilos y sicrotolerantes las hacen potencialmente útiles para procesos industriales que operen a temperatura ambiente en zonas de clima templado o frío, evitando el alto costo de mantener altas temperaturas durante el proceso. Esto se debe a que estas proteasas pueden mantener actividad óptima a temperaturas a las que las proteasas de organismos mesófilos sufren una reducción considerable en su eficiencia o actividad máxima. Por otra parte, la inestabilidad térmica característica de las enzimas adaptadas al frío puede tornarse en una propiedad deseable cuando sea necesario, por ejemplo, inactivar selectivamente la proteasa al cabo de finalizado el proceso, como puede ser el caso en su uso como aditivo en harinas de panificación o procesamiento y preservación de alimentos.

Reflexión final

El Instituto Antártico Argentino (http://www.iaa.gov.ar) desarrolla actualmente varias líneas de investigación relacionadas con los microorganismos sicrófilos, algunas de las cuales apuntan al aprovechamiento a gran escala de las capacidades de estos microorganismos. Entre estas líneas se encuentra, además de las mencionadas anteriormente, el estudio de bacterias capaces de utilizar hidrocarburos como única fuente de carbono y energía. Estos microorganismos son los únicos capaces de sostener un proceso de descontaminación (biorremediación) de suelos antárticos afectados por derrames de combustibles (ver CIENCIA Hoy, 77:40-47, 2003) y representan un buen ejemplo del aprovechamiento de la fisiología de los sicrófilos para obtener un beneficio. Además, como se mencionó anteriormente, el conocimiento de la biología y las capacidades de los sicrófilos tiene un enorme potencial en variados campos de la ciencia y la industria. El desarrollo de estas líneas, a través del esfuerzo combinado de grupos de investigación de los ámbitos público y privado podrá generar entonces no solo conocimiento sobre nuevos grupos de microorganismos, sino también nuevas herramientas en el campo de la biotecnología y la microbiología industrial.

Referencias Bibliográficas

• DEMING JW, 2002, ‘Psychrophiles and Polar Regions’, Current Opinion in Microbiology, 5: 301-309.
• MAC CORMACK WP, RUBERTO LAM, 2003, ‘Eliminación de hidrocarburos contaminantes en Antártida’, Ciencia Hoy, 77, 40-47.
• MADIGAN M, MARTINKO JM, PARKER J, 1999, Brock, ‘Biologia de los microorganismos’, 8a edición revisada, Prentice Hall Iberia, Madrid.
• VAZQUEZ SC, MAC CORMACK WP, 2002, ‘Effect of isolation temperature on the characteristics of extracellular proteases produced by Antarctic bacteria’, Polar Research, 21(1), 63-71.