FBA

Subprograma de Micología del PEEC
de FBA

La Dra. Nilda Fink, Directora del PROES de FBA, inició la transmisión desde el Salón de actos de la Federación Bioquímica a través del canal propio de la plataforma youtube anunciando la disertación de los Dres. María Victoria Zuliani y Amadeo Javier Bava, especialistas a cargo del subprograma de Micología del PEEC de FBA.
Por su parte, el Dr. Roberto García, presidente de FBA, señaló la importancia para el laboratorio clínico de éste subprograma del PEEC, que junto a los más de 20 en funcionamiento pudo organizar el Dr.Daniel Mazziotta. García presentó a la Dra. María Victoria Zubiani, como bioquímica por la UNLP, Farmacéutica, Especialista en Docencia Universitaria por la UNLP, Docente de la Cátedra de Micología de la Facultad de Ciencias Exactas, UNLP, Integrante del subprograma Micología del PEEC, que se desem peña actualmente en el Laboratorio de Micología del Instituto Biológico “ Tomás Perón “ de la ciudad de La Plata.
A continuación se refirió a los antecedentes del Dr. Amadeo Javier Bava: Médico, Doctor en Medicina, Profesor Titular de la Cátedra de Micología de la Facultad de Ciencias Exactas de la UNLP, Jefe de la Sección Parasitología del Hospital de Enfermedades Infecciosas “Francisco Javier Muñiz”, Referente en Parasitología de la Red de Laboratorios de la CABA y Coordinador del Sub Programa Micología del PEEC.

• Pneumocystis: Quistes de P. jiroveci sobre muestra de lavado broncoalveolar teñida con azul de toluidina (1000X)

Criptococosis

En la primera parte del encuentro la Dra. María Victoria Zuliani se refirió a la Cryptococosis como una micosis sistémica global que puede presentarse en forma aguda, subaguda o crónica y que compromete a los pulmones y al sistema nervioso central.
“La meningitis cryptococósica y su desenlace fatal se da en pacientes con sida y depende del estado inmunológico del paciente, de la carga fúngica inicial y de la virulencia de la cepa”, explicó. Y añadió que “en el mundo se producen anualmente 1 millón de casos de cryptococosis en la población HIV+, de los cuales 650 mueren”.
Si bien el género Cryptococos incluye200 especies, la mayoría de los casos son producidos por dos especies: C. neoformans y C. gattii. Pero dentro de estas especies hay distintas variedades y serotipos.
La especialista definió al género Cryptococcus como levaduras capsuladas, las únicas de importancia médica, reconocibles por la prueba de coloración con tinta china.
Y describió el agar CGB como un medio de cultivo útil para identificar y diferenciar desde el punto bioquímico el C,neoformans del gattii.
Zuliani señaló que “la infección por C. gattii se puede dar tanto en pacientes inmunocomprometidos como en pacientes inmunocompetentes”.

Fuentes de infección

La vía de infección en pacientes inmunocomprometidos es por inhalación de blastoconidios (forma asexual) y basidiosporos (forma sexual) presentes en la deyección de palomas y otros pájaros, y la corteza de árboles, hojas y frutos. Por inhalación estas formas del hongo llegan al pulmón y por vía sanguínea al sistema nervioso central. Puede producir una neumonitis. Ambas especies crecen a 37ºC pero C. neoformans es termotolerante y puede soportar hasta 42ºC en medio de cultivo.
La especialista se refirió a los distintos factores de virulencia de estas cepas como la cápsula. El switch fenotípico, la Melanina, la Ureasa, el Hierro y el Manitol.
En cuanto al diagnóstico, Zuliani hizo hincapié en la observación microscópica del centrifugado del líquido cefalorraquídeo ( LCR),señalando la utilidad de la coloración con tinta china. “Con el examen directo con tinta china se aprecian la cápsula y la gemación de las levaduras con aumento de 40X. En el informe se detalla observación de levaduras capsuladas compatibles con C. sp. También se pueden hacer coloraciones de Giemsa, accesible a cualquier laboratorio, se fija el pellet con metanol y se observan las levaduras monobrotantes y un halo que corresponde a la cápsula. También hay coloraciones típicas de micología como la de Grocott, la Mucicarmin, Alcian blue”.
Además explicó que” en el sobrenadante del LCR se dosan proteínas que van a estar aumentadas y glucosa que va a estar disminuida, así como se puede realizar la prueba del látex que también se puede hacer en suero. El sedimento del LCR –explicó– se cultiva en agar dextrosa Sabouraud en tubos en pico de flauta donde desarrolla como cepas mucoides por la cápsula. De ese desarrollo se hacen coloraciones con azul de lactofenol y se observa la levadura con un pequeño halo. Se completa la identificación con reacciones bioquímicas como la de ureasa, ureasa + es propio del género C.
Luego se cultiva el C. aislado en agar Níger o semilla de girasol que tiene compuestos fenólicos y se coloca como control negativo una cepa de candida albicans. “El cultivo en este medio produce una coloración marrón e identifica al genero C pero todavía no sabemos si es neoformans o gattii”, dijo la especialista. Y–agregó– el medio de cultivo GCB está más restringido a laboratorios especializados y es útil para diferenciar las dos especies.
Otra prueba bioquímica para el diagnóstico –apuntó– es la de aglutinación del látex que se hace en el sobrenadante del LCR. Es sencilla, rápida y de bajo costo y puede ser cualitativa y semicuantitativa. Tiene alta sensibilidad y especificidad y es útil para el seguimiento del tratamiento. “También se puede realizar en el suero del pac iente previa inactivación del mismo para evitar interferencias”, explicó.
“Es importante tener en cuenta que una prueba negativa no excluye la infección porque puede deberse a títulos bajos, infección temprana, efecto prozona por títulos altos o cepas no capsuladas”. Así como también puede dar falsos positivos por presencia de factor reumatoideo, ciertas bacterias, reactividad no específica en pacientes con HIV, entre otras causas.
Se refirió a la aparición hoy en día en el mercado de un test llamado LFI (Latera Flow Inmunoassay) 100% específico, similar a un Evatest. “Por ahora es muy costoso por ahora y solo ha llegado a laboratorios de referencia que lo utilizan en muestras de suero”. Y a la biología molecular como una tecnología restringida a laboratorios especializados.
La especialista destacó la importancia de un diagnósitoc temprano. “Cuanto antes se llega al diagnóstico mayor sobrevida para el paciente”, puntualizó.

Neumocistosis pulmonar

En la segunda parte de este encuentro, el Dr. Amadeo Javier Bava antes de comenzar su disertación hizo un breve reconocimiento a la figura del Dr. Mazziotta quien lo acercó al programa de FBA.
Se refirió a la neumocistosis pulmonar como “una enfermedad grave oportunista asociada a defectos inmunólogicos, sistémica, con manifestaciones clínicas pulmonares, cosmopolita y causada en los seres humanos por Pneumocystis jiroveci”.
Bava explicó que “desde su descubrimiento hecho por Carlos Chagas a principios del siglo XX hasta 1950 esta afección era una rareza. Sin embargo, la eclosión de la pandemia del sida hizo que la neumocitosis apareciera en casi todos los casos. Más recientemente, la incorporación de tratamientos antirretrovirales eficaces ha disminuido la incidencia de neumocistosis”.
Bava detalló que “Pneumocystis jiroveci es un organismo intermedio entre los hongos y los protozoarios. No tiene ergosterol en su membrana, sustanc ia presente en todos los hongos y que lo hace resistente a la anfotericina B y a los compuestos fenólicos. Y que tiene dos ciclos biológicos uno sexuado y otro asexuado.
El especialista destacó la importancia de la Infección asintomática “ porque el individuo es un portador y reservorio”. Y –señaló– que la forma pulmonar de la infección ocurre en pacientes inmunocomprometidos, no solo en pacientes con sida.

Manifestaciones clínicas

Bava describió las diferentes manifestaciones clínicas en los pacientes HIV+ y HIV-. “En HIV + la neumocistosis se presenta con fiebre, tos, disnea y malestar general que progresa en varias semanas previas al diagnóstico. Mientras que en pacientes HIV negativos la duración de los síntomas es más corta, evolución aguda, con elevada mortalidad sin tratamiento”.
El especialista enfatizó que “un día de diagnóstico puede salvar la vida del paciente”.
Entre las pruebas que se realizan anta la presunción de neumocitosis, Bava enumeró: “Se hace un placa de tórax y las pruebas de laboratorio: LDH y en sangre arterial los gases en sangre”.
Y –agregó– la confirmación es el diagnóstico de certeza y se hace a través de la observación microscópica aunque hay otros métodos más sofisticados actualmente.
“Lo ideal sería la implementación de un método rápido de diagnóstico aplicado sobre una muestra obtenida de forma no invasiva (sangre o buche bucal)”, dijo.
Datos de laboratorio
Bava explicó que ante esta infección se encuentran valores elevados de LDH mayores a 400UI, gases en sangre con valores de hipoxemia y en pacientes con sida recuentos de linfocitos TCD4+ menores a 200 cel/ul. El especialista señaló que “este microorganismo no desarrolla en medios de cultivo micológico por lo que requiere la visualización de un profesional entrenado”.
Enumeró las muestra en las que se puede hacer el diagnóstico por observación microscópica: esputo, buche, esputo inducido, lavado bronquial, broncoalveolar, biopsia transbronquial y biopsia a cielo abierto, esto último desaconsejado en pacientes HIV+. “El diagnóstico rápido es crucial y por lo general se usa tratamiento empírico”, dijo.
“El método de elección es el lavado bronco alveolar, es invasivo y requiere personal especializado e instalaciones”, señaló. Y –añadió– que el examen en fresco se hace con coloraciones específicas como Gomori- Groccot, azul de toluidina, Giemsa, entre otras, para teñir quistes y/o trofozoitos. El especialista destacó que” se requiere un buen microscopio y un muy buen entrenamiento. Y que en fresco se ven los cuerpos espumosos. Hay tinciones fluorescentes y técnicas inmunofluorescentes sensibles pero no muy específicas. La más específica es la coloración de Groccot.